教你气相色谱法测定啤酒酵母β—葡聚糖含量(1)
以啤酒酵母为原料提取β-葡聚糖，建立了一种气相色谱测定β-葡聚糖和甘露聚糖(副产物)含量的方法。样品用三氟乙酸(TFA)进行水解后，对水解单糖进行乙酰化，制备成糖腈乙酰酯衍生物，然后采用中极性柱进行气相色谱分析，最后以外标法定量测定。结果表明，β-葡聚糖和甘露聚糖的单糖成分经乙酰化后能得到较好的色谱分离效果，本实验制备的产品中β-葡聚糖和甘露聚糖的含量分别为32.39%和16.82%，回收率为87.14%-101.2%，此法可准确测定β-葡聚糖的含量。
本文借鉴了一些植物多糖中单糖组分的分析方法，采用气相色谱法直接测定葡萄糖含量，具有分析速度快、选择性强、灵敏度高和测定结果精确可靠等优点，从而为啤酒酵母中β-葡聚糖含量的测定提供新参考。
1材料与方法
1.1材料与试剂
啤酒酵母广州市珠江啤酒厂；β-葡聚糖日本ADEKA株式会社；风味蛋白酶、Alcalase2.4L诺维信公司；丙酮、三氟乙酸、盐酸羟胺、吡啶、乙酸酐等天津市化学试剂一厂，分析纯；标准葡萄糖、甘露糖上海源聚生物科技有限公司，分析纯。
1.2.1仪器与设备
本实验采用乙酰化作为衍生化方法，其反应原理是：标准单糖和盐酸羟胺在溶剂吡啶中加热反应生成糖肟，以乙酸酐作为乙酰化试剂，在加热条件下继续反应，最后生成具有挥发性的糖腈乙酸酯衍生物。
GC-2014气相色谱仪配备氢火焰离子化检测器FID，日本岛津公司；KQ-250DE型数控超声清洗器，昆山市超声仪仪器有限公司；雷磁PHS-3C精密pH计，上海精科仪器有限公司；N-EVAP111型氮吹仪，美国Organomation公司；5804R型高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D(III)型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。
1.2.2β-葡聚糖的制备
工艺流程：新鲜啤酒酵母→200目过筛除去啤酒花等杂质→水洗除去剩余啤酒→离心分离→将沉淀溶于水配成反应体系进行自溶→加盐破壁→碱性蛋白酶酶解→离心分离→水洗沉淀→脱色脱脂→冷冻干燥→粉碎→成品
操作要点：自溶，在pH7.0环境中，按反应体积1%的量加入风味蛋白酶，50℃下反应24h；破壁，在pH10.5环境中，按反应体积3%的量加入NaCl，搅拌混匀，80℃下保持1h；酶解，在pH10.5环境中，按反应体积1%的量加入Alcalase2.4L，搅拌混匀，80℃下反应3h。
1.3.1β-葡聚糖和甘露聚糖的单糖含量分析
方法制备的β-葡聚糖成品中可能还有些其他物质，如甘露聚糖和蛋白质，其中甘露聚糖是由甘露糖构成的同一聚糖，本实验同时测定甘露聚糖的含量，为β-葡聚糖含量的测定提供参考。
准确称取10mg固体单糖标准品(先在105℃下烘干至恒重)、10mg盐酸羟胺于1.5mL小离心管中，加入0.5mL吡啶，放入90℃水浴中加热反应30min，间歇振荡。取出后冷却至室温，加入0.5mL乙酸酐，90℃下继续水浴加热反应30min，离心后取适量上清液直接进行气相色谱分析。
1.3.2葡萄糖和甘露糖标准曲线的绘制
准确称取标准葡萄糖和甘露糖各10mg，乙酰化后，葡萄糖和甘露糖衍生物浓度同为10mg/mL，分别将此浓度葡萄糖和甘露糖衍生物按比例混合，配制成1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL和5mg/mL的混合糖液，同时做空白对照，立即进行气相色谱分析，记录色谱峰面积，以其为纵坐标，并以混合糖液中每种糖的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.3.3啤酒酵母多糖的水解和衍生化准确称取10mg多糖粉末于10mL离心试管中，加入2mL75%三氟乙酸，封管，90℃下水浴3h，间歇振荡，待酸水解完取出，将试管接入氮吹仪在80℃下蒸干，再加入1mL甲醇再次蒸干，重复3次，以去除残留三氟乙酸。
1.3.4色谱条件
气相色谱柱：DB-17石英毛细管柱(30m×0.32mm，液膜厚0.25μm，Agilent)；升温程序：初温为160℃，以5℃/min升温至180℃，再以2℃/min升温至210℃，保留5min；进样口温度：230℃，检测器温度：250℃；
载气(氮气)流速：20mL/min，氢气流速：45mL/min，空气流速：400mL/min；分流比20：1，进样量1μL。
乙酰化后，标准葡萄糖和甘露糖衍生物的气相色谱分析结果如图1所示，分析表明采用糖腈乙酸酯衍生化的方法，一种单糖只对应一种衍生化产物，在较低的200℃下即可分离出来。
两种标准单糖衍生物保留时间分别为14.347min和15.016min，分析表明在1.3.4所采用的气相色谱条件下，混合单糖中的两种单糖出峰时间短，峰形对称，隔得较开，并未出现拖尾现象。
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